IP-Coster | WO2023094844 | A PCR-BASED METHOD FOR THE ACCURATE DETERMINATION OF RELATIVE N6- METHYLADENINE AND 5-METHYLCYTOSINE LEVELS AT SPECIFIC GENOMIC SITES

Country	Stages	Total
China	Filing	1153
EPO	Filing, Examination	3621
Japan	Filing	590
South Korea	Filing	575
USA	Filing, Examination	2710

Abstract[English] The subject of the present innovation is a novel molecular biology method that consists of a DNA methylation-dependent restriction endonuclease-based enzymatic digestion of a given genome, ligation of the digested genomic fragments to a linker DNA called adaptor, and a PCR-(polymerase chain reaction) based amplification of the selected target site, using a forward primer that is specific to both downstream end of the linker sequence (10-15 nucleotides) and adjacent target genomic sequence (10-15 nucleotides). The quantity of the PCR product is directly proportional to the relative (normalized to an internal control) N6-methyladenine (6mA) or 5-methylcytosine (5mC) level at a target genomic site in a tissue sample (i.e., how many individual genomes in a tissue sample are methylated at a selected adenine or cytosine nucleobase). Specifically, the innovation is a molecular biology method, by which the relative 6mA or 5mC level at a given genomic site in a tissue sample can be accurately determined. The method involves a methylation-dependent restriction endonuclease-based digestion of the genome assayed, a subsequent ligation of a linker DNA (adaptor) to the digested genomic fragments, a primer-directed PCR reaction of digested site where the forward primer is simultaneously specific to both downstream end of the linker DNA and upstream end of the target genomic fragment ligated to the linker DNA, and, eventually, quantification of the PCR product. This way, the methylated (digested) genomic site is directly assayed. The quantity of the PCR product is directly proportional to the relative 6mA or 5mC level at the selected genomic site within a tissue sample consisting of a given amount of cells (individual genomes). The method provides a technical basis for epigenetic DNA diagnostics.[French] Le sujet de la présente innovation concerne un nouveau procédé de biologie moléculaire consistant en une digestion enzymatique d'un génome donné par une endonucléase de restriction dépendante de la méthylation de l'ADN, en une ligature des fragments génomiques digérés à un ADN de liaison appelé adaptateur et en une amplification par PCR (réaction en chaîne de la polymérase) du site cible sélectionné, à l'aide d'une amorce directe spécifique à la fois de l'extrémité aval de la séquence de liaison (10 à 15 nucléotides) et de la séquence génomique cible adjacente (10 à 15 nucléotides). La quantité du produit de PCR est directement proportionnelle au niveau relatif (normalisé par comparaison avec un témoin interne) de N6-méthyladénine (6mA) ou de 5-méthylcytosine (5mC) sur un site génomique cible dans un échantillon tissulaire (c'est-à-dire le nombre de génomes individuels dans un échantillon tissulaire méthylés au niveau d'une nucléobase adénine ou cytosine sélectionnée). Plus particulièrement, la présente innovation consiste en un procédé de biologie moléculaire permettant de déterminer avec précision le niveau relatif de 6mA ou de 5mC sur un site génomique donné d'un échantillon tissulaire. Le procédé comprend une digestion du génome à doser, reposant sur une endonucléase de restriction dépendante de la méthylation, une ligature ultérieure d'un ADN lieur (adaptateur) aux fragments génomiques digérés, une réaction de PCR dirigée par une amorce sur le site digéré où l'amorce avant est simultanément spécifique de l'extrémité aval de l'ADN lieur et de l'extrémité amont du fragment génomique cible ligaturé à l'ADN lieur, et, enfin, la quantification du produit de la PCR. De cette manière, le site génomique méthylé (digéré) est directement dosé. La quantité du produit PCR est directement proportionnelle au niveau relatif de 6mA ou de 5mC sur le site génomique sélectionné dans un échantillon tissulaire composé d'une quantité donnée de cellules (génomes individuels). Le procédé constitue une base technique pour les diagnostics épigénétiques de l'ADN.

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Micro Entity, US	*
Entry into National Phase under	Chapter I *
Translation

WO2023094844 - A PCR-BASED METHOD FOR THE ACCURATE DETERMINATION OF RELATIVE N6- METHYLADENINE AND 5-METHYLCYTOSINE LEVELS AT SPECIFIC GENOMIC SITES

Quotation for National Phase entry